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Negli anni di Clistene, ad Oriente, si preparava la grande minaccia persiana. Era re dei Persiani Dario I il quale, dopo aver organizzato solidamente il suo immenso impero, si preparava ad estenderlo verso occidente. I Persiani dell'epoca non erano affatto dei barbari, erano detentori di una grande cultura e vivevano sotto un ordinamento complesso che faceva capo alla persona del re. Diversamente da quanto succedeva, ad esempio, in Egitto, il re non era considerato un dio, tuttavia era dal dio della luce Ormudz che egli riceveva direttamente la sua autorità e ciò lo rendeva signore assoluto degli uomini, tanto che chiunque comparisse alla sua presenza doveva prostrarsi al suolo. E' chiaro che questa mentalità non avrebbe potuto essere più lontana da quella greca che si basava fondamentalmente sul concetto di uguaglianza dei cittadini e sulla loro autonomia. Inoltre i Greci, abitatori delle loro città-stato, guardavano con avversione e timore lo sterminato impero persiano, impossibilitati a comprendere la convivenza in una stessa nazione di tanti popoli, culture e religioni differenti. Questo atteggiamento però era tipico soltanto di quelle città che più avevano contribuito alla formazione del pensiero politico ellenico, prime fra tutte Sparta ed Atene. Le colonie greche dell'Asia Minore, invece, avevano accolto da tempo l'influenza persiana. In alcuni casi si trovavano in condizione di dipendenza economica nei confronti del grande impero orientale, ed in generale erano inclini ad accettare una blanda soggezione alla Persia ricevendo in cambio protezione da altri potenziali invasori. Versavano quindi moderati tributi ai Persiani e si impegnavano anche ad inviare truppe e navi in caso di guerra. Quando nel 514 Dario decise un grande reclutamento per muovere verso Occidente, con la principale intenzione di attaccare le tribù sciitiche oltre il Danubio, anche le colonie greche dell'Asia minore dovettero contribuire. L'esercito Persiano doveva oltrepassare il Bosforo su un ponte di navi e fu ad un architetto ionico, Mandrocle di Samo, che venne affidata la direzione della costruzione del ponte. La spedizione non ottenne importanti risultati e dopo due mesi Dario ed il suo esercito tornarono in Persia lasciando il generale Megabazo in Tracia, unica regione di cui la spedizione era riuscita ad assicurare il controllo. Nei due anni successivi Megabazo consolidò la conquista della Tracia e delle città greche che vi erano situate. Questi eventi ed il controllo del Bosforo da parte dei Persiani, finirono con il danneggiare fortemente gli interessi economici delle città ioniche della Grecia orientale, ne nacque un malcontento nei confronti dei Persiani che sfociò nell'insurrezione di Mileto dell'anno 500. I milesi insorti cercarono aiuto presso la madre patria ma i Greci non avevano ancora sviluppato il minimo senso di coesione nazionale e quindi non si resero conto di essere tutti in pericolo davanti alla minaccia persiana. Solo Eretria ed Atene accettarono di aiutare Mileto ed inviarono rispettivamente cinque e venti navi. I ribelli ed i loro alleati attaccarono nel 499 la città di Sardi e se ne impadronirono, ma poiché la rocca era rimasta nelle mani del satrapo Artaferne ed un esercito persiano già arrivava in suo soccorso i Greci furono costretti a ritirarsi ad Efeso. La reazione persiana non tardò: le forze di Dario presto invasero la Ionia e sottomisero molte città, soggiogarono definitivamente anche l'isola di Cipro che, nel frattempo, si era unita all'insurrezione. Le colonie greche resistettero con grande tenacia (ma non scarsa organizzazione) per cinque anni, alla fine la flotta di Dario ebbe la meglio sulle duecento navi greche comandate da Dionisio di Focea. Mileto venne attaccata contemporaneamente dal mare e dall'entroterra e fu rapidamente conquistata e distrutta (494). Le case ed i templi furono incendiati, la popolazione deportata. La notizia della caduta di Mileto sconvolse l'Ellade diffondendo il panico: basti pensare che quando nel 493 il poeta Frinico presentò ad Atene la tragedia La presa di Mileto fu processato e multato per aver affrontato pubblicamente l'argomento che più addolorava i suoi concittadini. Era però soltanto l'inizio, la vera guerra greco-persiana sarebbe scoppiata nel 490, con lo sbarco di Dario nell'Attica e con la famosa battaglia di Maratona.