Quarta figlia di Ferdinando II e di Isabella di Castiglia, nacque a Cordova il 29 giugno 1482.
Sposò Manuele I del Portogallo, vedovo di Isabella di Trastamara. Poiché Isabella e Maria erano sorelle era necessaria la dispensa ecclesiastica che fu concessa da Luigi Borgia, figlio del papa Alessandro VI, appositamente creato arcivescovo di Valencia dai genitori della sposa.
Il matrimonio fu celebrato nel 1500 e da allora Maria visse a Lisbona dove morì nel 1517.
Maria e Manuele ebbero dieci figli: Giovanni III del Portogallo successore del padre, Isabella del Portogallo, Beatrice, Luigi, Ferdinando, Alfonso, Maria, Enrico, Eduardo, Antonio.