Figlia di Filippo IV di Spagna e di Marianna d'Austria, nacque a Madrid il 12 luglio 1651.
Fu di salute cagionevole a causa dello stretto rapporto di consanguineità dei genitori ma non ebbe le malattie gravi e i difetti fisici che colpirono il fratello minore Carlo II.
Le leggi spagnole ammettevano la successione al trono delle figlie in caso dimancanza di figli maschi e le pessime condizioni di salute di Carlo II rendevano molto probabile che Margherita Teresa ereditasse la corona anche perché la sorella maggiore Maria Teresa aveva rinunciato ai suoi diritti ereditari per sposare il re di Francia Luigi XIV.
L'imperatore Leopoldo I intendeva sposare Margherita Teresa e sollecitava il fidanzamento mentre il padre di lei temporeggiava in attesa di sviluppi della salute di Carlo II.
Filippo IV morì nel 1665 e le nozze furono finalmente celebrate per procura il 25 aprile 1666. Il 6 dicembre Margherita giunse a Vienna dove si svolse la cerimonia del matrimonio ufficiale alla quale seguirono mesi di festeggiamenti.
Il matrimonio sarebbe forse stato felice se non fosse stato funestato da diversi aborti di Margherita e da morti neonatali dei figli della coppia. Anche Margherita e Leopoldo erano consanguinei e per i conseguenti problemi genetici Margherita riuscì a portare a termine solo quattro gravidanze e solo la seconda figlia, Maria Antonia d'Austria, raggiunse l'età adulta.
Ancora incinta nel gennaio 1673, si ammalò gravemente e morì il 12 marzo 1673 di congestione polmonare, aveva solo ventuno anni.
Leopoldo, benché addolorato per la perdita, per avere un erede maschio si risposò con Claudia Felicita d'Austria senza attendere il compimento dell'anno di lutto ma anche dalla seconda moglie non ebbe figli maschi, riuscì in questo soltanto con la terza, Eleonora del Palatinato-Neuburg che non apparteneva alla casata degli Asburgo.