Figlia di Massimiliano II d'Asburgo e di Maria di Spagna, nacque a Cigales in Spagna il 1° novembre 1549, crebbe alla corte paterna a Vienna e ricevette un'educazione cattolica.
Fu promessa al cugino Don Carlos infante di Spagna ma poiché questi morì nel 1568 prese il suo posto il padre Filippo II re di Spagna che era rimasto vedovo e privo di figli maschi.
Filippo, che aveva quarantatre anni ed era il fratello della madre di Anna, la sposò per procura nel maggio 1570 e Anna lo raggiunse nel mese di ottobre. Si diceva che Filippo si innamorò di questa giovane moglie, per lui la quarta, dalla quale ebbe cinque figli.
Anna, regina consorte di Spagna, divenne anche regina consorte del Portogallo dal 12 ettembre 1580 quando Filippo ereditò il trono del defunto re Enrico I in base ai diritti della sua prima moglie Maria Emanuela d'Aviz.
Durante il viaggio verso Lisbona, Anna si ammalò e morì a il 26 ottobre 1580 a soli trentun'anni. Dei suoi cinque figli uno solo, Filippo, raggiunse l'età adulta e divenne re di Spagna come Filippo III.