Figlia di Carlo II d'Austria e di Maria Anna di Baviera, nacque a Graz il 25 dicembre 1584 ed ebbe dalla nascita il titolo di arciduchessa d'Austria.
Il suo matrimonio con il cugino Filippo III di Spagna fu celebrato per procura a Ferrara nel 1599 e in seguito confermato a Madrid, con queste nozze Margherita assunse il titolo di regina consorte di Spagna.
Durante il viaggio da Ferrara a Madrid visitò Milano dove le venne dedicato un salone nel Palazzo Ducale (poi Palazzo Reale) che fu chiamato in suo onore Salone Margherita e che fu destinato alle rappresentazioni di musica lirica.
Come regina consorte si interessò del governo ed influenzò il marito che era notoriamente poco determinato.
Margherita e Filippo ebbero otto figli di cui solo cinque divennero adulti: Anna (che fu moglie di Luigi XIII di Francia), Filippo (successore del padre come Filippo IV), Maria Anna, Carlo e Ferdinando.
Morì a San Lorenzo del Escorial il 3 ottobre 1611. Don Rodrigo de Calderon, segretario dell'ex-primo ministro duca di Lerma, fu accusato di averla avvelenata e venne giustiziato.