Figlio di Alfonso I d'Este e di Lucrezia Borgia, nacque a Ferrara il 5 agosto 1509.
Insieme al fratello Ercole ricevette una raffinata educazione umanistica prima a Ferrara poi all'università di Padova. Destinato dall'infanzia alla carriera ecclesiastica, prese gli ordini minori nel 1519 e l'anno successivo a soli undici anni fu creato vescovo di Milano dal papa Leone X.
Nel 1538 fu nominato cardinale da papa Paolo III e trascorse lunghi periodi in Francia alla corte di Francesco I.
Nel 1550 sostenne la candidatura al soglio pontificio di Giovanni Maria Ciocchi del Monte che fu eletto papa e prese il nome di Giulio III. Questi conferì ad Ippolito il governo di Tivoli dove il cardinale fece costruire la famosa Villa d'Este.
Ippolito II, che nel 1552 ottenne anche il titolo di governatore di Siena, fu mecenate e uomo di vasta cultura.
Morì a Roma il 2 dicembre 1572 e fu sepolto a Tivoli nella chiesa di Santa Maria Maggiore.