Secondogenito di Isabella di Castiglia e di Ferdinando II d'Aragona, nacque a Siviglia il 30 giugno 1478 e come primo figlio maschio della coppia reale ebbe il titolo di principe delle Asturie, cioè di erede ai troni di Castiglia e di Aragona.
Rachitico, affetto da labioschisi ed estremamente cagionevole il piccolo principe ebbe un'infanzia tormentata da malanni di ogni tipo.
Nel 1488 i suoi genitori combinarono un duplice fidanzamento fra i propri figli Giovanni e Giovanna e quelli dell'imperatore Massimiliano, Margherita e Filippo.
Giovanni sposò Margherita per procure il 5 novembre 1496 mentre le nozze ufficiali furono celebrate a Burgos il 3 aprile 1497.
L'unione fra i due sposi sembrò intensa ed appassionata tanto che alle loro intime frequentazioni fu attribuito l'attacco di febbre che il 4 ottobre 1497 portò Giovanni alla tomba.
L'eredità della corona di Castiglia passò alla sorella di Giovanni Isabella, ma poiché questa premorì alla madre il titolo fu ereditato dalla sorella minore Giovanna la Pazza poi dal figlio di lei Carlo V.