Figlia di Vincenzo I Gonzaga duca di Mantova e del Monferrato e di Eleonora de'Medici, nacque a Mantova il 23 settembre 1598.
Nel 1622 sposò l'imperatore Ferdinando II d'Asburgo che dal 1616 era vedovo della prima moglie Maria Anna di Baviera e acquisì con il matrimonio i titoli di imperatrice, arciduchessa d'Austria, regina d'Ungheria e Boemia.
L'unione matrimoniale e l'acquisita parentela dell'imperatore con i Gonzaga non impedirono che nel 1630 le truppe imperiali assediassero e saccheggiassero Mantova nel corso della Guerra di Successione Mantovana, uno dei conflitti verificatisi nel più ampio contesto della Guerra dei Trent'anni.
Eleonora non ebbe figli e curò l'educazione di quelli del marito.
Fondò conventi carmelitani a Vienna e a Graz.
Morì a Vienna il 27 giugno 1655.