Figlia di Filippo III re di Spagna e di Margherita d'Austria-Stiria, nacque a Valladolid il 22 settembre 1601 e ricevette alla nascita i titoli di infanta di Spagna e di Portogallo, arciduchessa d'Austria e principessa reale di Borgogna e dei Paesi Bassi.
Nel 1615 sposò Luigi XIII di Francia al quale era stata fidanzata cinque anni prima e contemporaneamente il fratello minore Filippo (futuro Filippo IV) sposò la sorella di Luigi XIII, Elisabetta di Borbone.
Il giovane sposo si mostrò a lungo indifferente nei confronti della moglie e nutrì un profondo rancore verso la madre Maria de'Medici che l'aveva costretto a sposarla.
Pericoloso avversario di Anna fu il cardinale Richelieu che volendo portare avanti una politica antispagnola non vedeva volentieri la figlia del re di Spagna come regina francese. Il cardinale si impegnò per privare anna della fiducia del marito tanto che Luigi XIII stabilì che se Anna avesse avuto la reggenza avrebbe dovuto essere affiancata (e controllata) da un consiglio.
Il primo figlio della coppia reale, Luigi Deodato (poi Luigi XIV), nacque il 15 settembre 1638 quando la regina aveva ormai trentasette anni, fu grande lo stupore a corte e corse voce che furono circostanze fortuite a portare i due coniugi, normalmente tanto distanti, a trascorrere una notte di intimità.
Il secondo figlio, Filippo di Francia duca di Orleans, nacque nel 1640. Nel 1642 morì Richelieu e nel 1643 fu la volta di Luigi XIII. Anna d'Austria ebbe la reggenza per il figlio Luigi XIV con la ratifica del parlamento che annullò le restrizioni poste da Luigi XIII. Inaspettatamente confermò al governo il cardinale Mazzarino, uomo di Richelieu, e continuò a sostenerlo, si sospettò infatti chei due fossero amanti o che fossero segretamente sposati (cosa possibile per il cardinale che aveva preso soltanto i voti minori).
Durante la sua reggenza, che ufficialmente durò fino al 1651, Anna concluse con l'aiuto di Mazzarino la pace di Vestfalia che mise fine alla guerra tra Francia e Impero. Dovette affrontare il mancontento dei sudditi e dell'aristocrazia che si manifestò nelle Fronde del 1648 e dek 1650 - 1652. La prima fu repressa dal Condè mentre la seconda divenne una vera e propria guerra civile combattuta in tutta la Francia.
Al termine di questo periodo Anna, che continuava ad avere piena influenza sulla politica del giovane Luigi XIV ormai dichiarato abile a regnare, si occupò insieme a Mazzarino di concludere la guerra con la Spagna.
L'obiettivo fu raggiunto con la Pace dei Pirenei del 7 novembre 1659, molto vantaggiosa per la Francia, che comprendeva anche gli accordi per il matrimonio fra Luigi XIV e Maria Teresa d'Asburgo figlia di Filippo IV.
Nel 1661 morì Mazzarino e Anna si ritirò dalla politica. Scoperto di avere un tumore al seno trascorse un periodo in convento, quindi si stabilì al Louvre dove morì il 20 gennaio 1666.